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在人类辅助生殖技术（ART）助孕过程中，常使用人绒毛膜促性腺激素(HCG)诱导卵母细胞最终成熟，并发生排卵。有研究认为受精时机是决定胚胎活力的重要因素，HCG注射后不同的授精时间可能影响卵母细胞的成熟、后续受精及发育潜能。

卵胞浆内单精子注射（ICSI）借助显微操作技术将单个精子注射到卵母细胞胞质中，很大程度改善了男性因素导致的不育情况，且受精率较高，有效预防了受精失败，应用广泛。ICSI操作的最佳时机目前尚无统一标准。本文采取回顾性分析的方法，探讨HCG后授精时机对ICSI助孕结局的影响。

材料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2013年9月至2015年6月在河南省人民医院生殖医学研究所行ICSI助孕治疗患者的临床资料。

纳入标准：（1）女性患者年龄38岁；（2）采用我中心常规标准长方案行促排卵；（3）阴道超声引导下穿刺取卵，5个获卵数20个；（4）男方精液质量控制：禁欲3～7d，手淫取精，精子总数＜5106条，a＋b＋c级精子10%，形态正常精子4%，离心沉淀法处理精液。共纳入831个周期。

参照既往文献资料及我中心临床经验，将选取的831个周期根据注射HCG后授精时间的不同分为5组，A组：注射HCG后＜40h授精（n=44）；B组：注射HCG后40～＜41h授精（n=162）；C组：注射HCG后41～＜42h授精（n=313）；D组：注射HCG后42～＜43h授精（n=243）；E组：注射HCG后43h授精（n=69）。

二、方法

1.标准长方案促排卵：患者在前一个月经周期的黄体中期开始皮下注射促性腺素释放激素激动剂（GnRH-a）（曲普瑞林，达必佳，0.1mg/支，辉凌，德国）0.1mg/d，当达到降调节标准[雌二醇（E2）＜180.00pmol/L，孕酮（P）＜3.14nmol/L，子宫内膜厚度5mm]后，曲普瑞林剂量改为0.05mg/d直至HCG日，同时使用基因重组卵泡刺激素（r-hFSH，果纳芬，75U/支，默克-雪兰诺，德国）结合HMG（75U/支，珠海丽珠）刺激卵泡发育，根据阴道超声监测卵泡发育情况和血清激素水平调整用药方案。

当3个卵泡直径18mm时，注射HCG（2000U/支，珠海丽珠）5000～10000U诱导排卵。HCG注射后36.5～37.0h，阴道超声引导下取卵。将所获得卵冠丘复合物放入提前1d平衡过夜的G-IVF培养液（Vitrolife，瑞典）中，6%CO2、5%O2、37℃条件下培养1h以上。

2.脱颗粒细胞：ICSI前1h将卵丘复合物由G-IVF培养液移至预热的透明质酸酶（hyaluronidase，80U/ml，SAGE，美国）消化，毛细管吹打，轻柔脱去颗粒细胞。再将卵母细胞置于G-IVF培养液中6%CO2、5%O2、37℃条件下继续培养1h。

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3.ICSI操作：挑选有明显第一极体的成熟卵母细胞置于G-MOPS（Vitrolife，瑞典）液滴中，使用Holding针将极体固定于点位置。将处理过的男方精子放入7%聚乙烯吡咯烷酮（PVP，SAGE，美国）的微滴中，肉眼观察，挑选形态正常、活力较好的精子，注射针制动后，行显微注射。将回吸的胞浆、精子和尽量少的PVP注入卵胞浆，缓慢退出注射针。然后充分洗涤已注射的卵母细胞，再将其移至提前1d平衡过夜的G-1培养液（Vitrolife，瑞典）中，6%CO2、5%O2、37℃条件下培养。

4.受精观察及胚胎评价：授精后16～20h观察受精情况，以出现两个原核及两个极体作为正常受精的标准。随后每隔24h进行1次观察，记录下胚胎早期卵裂及发育情况，参照DaleB标准行早期胚胎评分。

依据卵母细胞形态学将早期胚胎划分为4级：

Ⅰ级胚胎：卵裂球大小均匀，形态规则，透明带完整；胞质均匀，无颗粒现象；碎片＜5%；

Ⅱ级胚胎：卵裂球略不均匀，形状略不规则；胞质可出现颗粒现象，碎片在10%～20%范围内；

Ⅲ级胚胎：卵裂球大小明显不均匀，可出现明显的形状不规则，胞质有颗粒现象，碎片较多，在21%～50%之间；

Ⅳ级胚胎：细胞大小严重不均匀，胞质有严重的颗粒现象，碎片＞50%。

一般认为Ⅰ、Ⅱ级胚胎具备较好的着床能力，Ⅲ级胚胎着床潜能减弱，Ⅳ级胚胎几乎不具备着床能力。

5.观察指标及评价：主要观察指标有获卵数、MⅡ卵数、正常受精（2PN）数、卵裂数、可利用胚胎数、移植胚胎数、胚胎种植率、临床妊娠率和早期流产率。

其中，胚胎种植率=超声下可见孕囊数/移植胚胎数100%，临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数100%，早期流产率=发生早期流产的周期数/临床妊娠周期数100%。

胚胎移植及妊娠评价：取卵后72h进行胚胎移植，移植至少1～2枚可利用胚胎。我中心可利用胚胎的选择标准为第1天（D1）正常受精，D2至D3至少增长2个卵裂球，同时D3胚胎为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎。

行常规黄体支持，胚胎移植14d后检测血清HCG水平，血清HCG100U/L时视为生化妊娠；胚胎移植后28d，阴道超声下可见孕囊者视为临床妊娠。

三、统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学处理，计量资料用均数标准差(`s)表示，组间比较采用方差分析和卡方检验及独立样本的2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、患者一般情况

各组患者的平均年龄、不育年限、基础FSH水平等指标比较，均无显著差异(P＞0.05)（表1）。

二、各组患者ICSI助孕周期临床及实验室指标比较

各组患者的获卵数、成熟卵母细胞数、正常受精数、卵裂数、可利用胚胎数、移植胚胎数、临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率等比较，均无显著性差异(P＞0.05)（表2）。

但综合评估临床及实验室指标发现，C组（注射HCG后41～＜42h）行ICSI授精的临床结局相对最优：临床妊娠率70.58%，胚胎种植率53.63%，早期流产率3.79%。B组（注射HCG后40～＜41h）行ICSI授精的临床结局次之（临床妊娠率70.19%，胚胎种植率54.00%，早期流产率8.22%）。

A组（注射HCG后＜40h）虽然临床妊娠率（74.07%）在5组中最高，但A组的胚胎种植率（45.28%）明显偏低，且早期流产率（20.00%）有高于其他各组的趋势。D组（注射HCG后42～＜43h）和E组（注射HCG后43h）的临床妊娠率、胚胎种植率则开始出现下降趋势，早期流产率开始升高（表2）。

讨论

常规ART助孕中，常使用外源性促性腺激素对患者进行控制性超促排卵，促进一个排卵周期中的多个卵泡发育，以获得比较多的成熟卵母细胞来提高每个周期的平均妊娠率。在促排卵过程中，一般使用外源性HCG来模拟黄体生成素（LH）峰以促使卵母细胞最后成熟，达到诱导排卵的目的。

卵母细胞的成熟包括核成熟和胞质成熟及透明带成熟，核质成熟的不同步化，是限制卵母细胞发育能力的主要因素之一。Kilani等对成熟卵母细胞纺锤体的研究显示，减数分裂纺锤体的出现与注射HCG后的时间有很大的相关性，多数MⅡ期卵母细胞在HCG注射后的39～40.5h可观察到纺锤体且有最高的阻滞值。

Cooke等和Kilani等通过观察ICSI授精时卵母细胞纺锤体的出现频率与妊娠结局的关系，认为ICSI时卵母细胞出现纺锤体，且当纺锤体阻滞值高时，卵母细胞受精后其妊娠结局较好。Rienzi等的研究结果认为在取卵术后，进行短时间的体外培养有助于卵母细胞细胞核及胞质的进一步成熟。

陈浩杰等对家兔进行超促排卵后，在注射HCG后14、16、18h不同的时间段取卵，然后进行ICSI操作，观察兔胚胎在体外发育的情况，3组的受精率分别为82.2%、75.9%和0；桑椹胚形成率分别为92.9%、70.0%、0；囊胚形成率分别为62.2%、53.3%、0。

该研究提示精子核的去浓缩及原核形成是胚胎发育的必需过程，雄原核形成失败与卵母细胞中较低的低谷胱甘肽活性相关。卵母细胞成熟后随着体外培养时间的延长，谷胱甘肽被逐渐消耗，可能损害雄原核的发育，造成受精率降低，注射体外培养时间较长的卵母细胞可能增加纺锤体损伤的机会，继而降低后期的胚胎发育潜能。

受精时机是决定胚胎发育潜能的重要因素之一，本研究关注ICSI助孕治疗中HCG注射后的授精时间对妊娠结局的影响。

注射HCG后卵母细胞的受精时间作为影响IVF妊娠结局的重要因素，如果授精时间过早，可能存在卵母细胞核质并未充分成熟，纺锤体等细胞器尚未为精卵结合做好充分准备，继而影响妊娠结局；若授精时间过晚，则会造成卵母细胞的过熟而错过最佳授精时机，也会影响妊娠结局。但HCG注射后的授精时机目前尚无统一标准，Dozortsev等研究发现HCG注射后37～41h行ICSI授精的种植率达到最高。

结果显示各组间虽无统计学差异，但综合评估胚胎种植率与早期流产率等因素发现，注射HCG后41～42h行ICSI授精的胚胎种植率略高于＜40h及43h授精组，早期流产率略低于＜40h及43h授精组，临床结局有优于这二组的趋势；注射HCG后40～41h者临床结局较41～42h者稍次之。

本研究中＜40h组的早期流产率有高于其他各组的趋势，提示其胚胎发育潜能可能受到了影响；且其与43h组授精患者例数偏少，可能存在一定程度的偏倚，因此造成这种结果的原因有待于进一步深入探讨。

综上所述，本研究的意义在于根据自身实验室条件，在现有人员、设备数量的基础上，更加合理地安排胚胎实验室工作，可以通过与临床负责诱导排卵的医师及时沟通，根据当日工作量合理安排注射时间。实际工作中可以选择错时注射HCG，错时取卵，以便实验室根据患者HCG注射时间及手术量合理安排ICSI操作时间，尽可能在最佳时间段内完成授精任务。

虽然5组患者的各项指标比较均无统计学差异，但HCG后41～42h行ICSI授精的临床结局有优于其他组的趋势，提示临床工作中可以选择HCG注射后41～42h行ICSI操作，有时为了方便临床工作安排，可以酌情放宽至40～42h。但其具体机制及操作时间尚需进一步研究探讨。

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